日内瓦大学发现顶端前体细胞参与新皮层发育的时程可塑性修边机

2019年8月28日，来自瑞士日内瓦大学的Denis Jabaudon研究组在Nature杂志在线发表了题为Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouseneocortex的研究论文，通过流式细胞技术特定分离顶端前体细胞和中端前体细胞，并异时移植（heterochronical transplantation）至低龄胚胎，从而对其各自神经元子代的分化图谱进行详细研究，发现了新皮层不同类型前体细胞在分化时程可塑性 （temporal plasticity）上具有多样性，并进一步揭示了某些特定亚型的前体细胞不受限于其正常分化进程而重新退回至过去的某一发育阶段。该研究为同一课题组此前于2019年5月在Science杂志发表的Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex的延伸，进一步帮助我们理解正常神经发育如何受内、外部线索及环境许可、指引信号事件的影响，从而指导我们如何利用这些机制进行神经再生研究。

首先，为研究APs的分化命运可塑性 （fate plasticity），研究人员基于课题组前期建立的技术，即一种相对新颖的神经元标记技术——FlashTag脉冲标记，对CAG-mRFP1供体小鼠进行标记，随后通过流式细胞迅速分离FlashTag+细胞，并于迁移结束期，即P7时，对其神经分化后的子代神经元分化命运进行确认 （RFP+，图1a）。

研究人员将APs细胞在胚胎发育E15.5或E12.5分别进行等时移植 （isochronic transplantation）作为对照组 （文中将这两种等时移植分别标记为AP15?15及AP12?12）。选择该两个时间点的原因是，SL神经元 （即L4及L2-3层神经元）在E15.5形成，而DL神经元 （即L6及L5层神经元）在E12.5形成。研究人员也对APs细胞进行了异时移植，即将E15.5 APs移植入E12.5宿主胚胎，此处标记为AP15→12。与既往报道一致的是，在P7时，AP15→15及AP12→12均能产生正确皮层分层特征的子代神经元 （图1b-c）：AP15→15产生SL神经元，而AP12→12产生DL及SL神经元，也就是说，SL神经元的生成晚于DL神经元。

图1. APs在E15.5期仍保留生成出生较早的皮层深层神经元

然而，研究人员意外发现，AP15→12子代神经元也存在于DL及SL （图1d），这与AP12→12产生的子代神经元皮层分层定位特征是一致的，提示AP15神经元分化潜能 （neurogenic competence）具备短暂的可塑性。随后，研究人员对AP15→12子代神经元的分子特征进行了进一步确认，发现这些子代神经元的皮层分层定位与传统的皮层各层特异性分子标志物一致 （图2a-c）。轴突投射特征也与其分层定位特征及分子标志物特征一致，即AP15→15产生的子代神经元投射至皮层内区域而不投射至皮层下结构，而AP15→12产生的子代神经元与AP12→12一致，均仅投射至皮层下结构 （图2d）。这些数据揭示了AP15→12产生的子代神经元对于皮层分层、分子及环路联系等特征具有依赖不同胚胎发育期的重定向能力（respecification）。

图2. AP15?12子代神经元具有胚胎发育期依赖性的分子及环路联系特征

虽然大部分AP15→12具有分化命运可塑性的特性，但是仍有小部分AP15→12在分离至供体胚胎时并未表现出该可塑性 （占比为13.7%），研究人员认为有可能存在前有丝分裂 （pre-mitotic）的重定向机制 （图3d-e；Note：此图来自于补充数据Supp Fig. 4，笔者认为有助于理解全文，故将此图置于此处）

图3. 发现移植新生神经元的研究方法。使用EdU标记法区分新生供体神经元及在宿主内新生的神经元 （来源自原文补充数据Supp Fig.4）。

因此，为研究AP15→12细胞状态如何改变，研究人员进行了Patch-seq研究 （图4a-b），对近脑室的RFP+神经元进行了RNA-seq。Patch-seq为近年来神经生物学家开始应用于神经细胞单细胞组学研究的新兴技术，可同时提供单个神经元的电生理学、转录组学及形态学信息（Note：笔者在哈佛医学院期间曾与多位同行聊到此技术，这种基于膜片钳技术的单细胞分离手段虽然通量较低，如本文中每组只采集到约20个细胞，但对于捕获细胞量少的重要样品的研究具有一定意义，尤其在单细胞尺度上联系电生理学特性、形态学、解剖学联系及转录组学等方面，笔者认为该技术具有良好应用前景）。通过Patch-seq，研究人员发现AP15→12可抑制AP15-类型的转录程序，并重新表达AP12-类型的转录程序，从而发现了在异时移植后动态调节的基因 （图4c-d）。重新诱导出的转录因子包括：（1）可抑制神经元分为并促进皮层APs自我更新的Wnt-通路调节因子Tcf7l1；（2）调节APs神经分化潜能进程的关键调节因子Ezh2（为PRC2甲基转移酶，与该课题组今年于Science报道的PRC2参与调控APs时间进展的结论一致）。Wnt通路在AP15→12内的转录重激活提示其在APs的重定向过程中具有重要作用。因此，这些数据表明AP15→12回溯至早期神经分化潜能的特性与其分子特征的时程倒回 （temporal rewind）相关。

图4. 异时移植后，AP15被重定向为AP12。

分子水平上AP15→12重回溯至类似于AP12的重定向能力是否也能在功能特征上保持一致？研究人员选定三种发育时序阶段关键生理指标进行检测，包括膜静息电位、神经分化特征及子代克隆大小 （图5），均发现AP15→12在分子水平及生理功能水平上均可倒退重回至早期的发育状态，换言之，表现出“返老还童”（rejuvenation）特征（Note：笔者认为原文中使用a wholesale rejuvenation表达欠妥，愿读者适量斟酌）

图5. AP15被重定向为AP12后的三种关键生理特征：膜静息电位、神经分化特征及克隆大小。

与APs多次分裂的特征不同，IPs在达到终点分裂 （terminaldivision）前只有一至两次分裂的能力。因此，研究人员推测，若AP15具有分化时程可塑性，那么IP15则应该只能定向分化产生SL神经元。为证明这一假设，研究人员同样在E15.5胚胎期进行了FlashTag脉冲标记，而特意延迟10小时后收集细胞，以确保IPs子代神经元进行了分化。基于此，研究人员进行了此前在APs上开展的类似移植工作，发现IP15→12的确只能生成SL神经元 （图6），这也确认了IP15为细胞命运已经决定的前体细胞，即只具有定向分化成SL神经元的潜能。

图6. 胚胎期E15.5的IPs定向生成SL神经元。

最后，研究人员为确定Wnt在这一重定向现象中的作用，对AP15→12诱导的Wnt信号激活相关的转录程序进行了研究。研究人员首先体外分离了AP15，并检查了其子代神经元在通过药理学手段激活Wnt通路后或者暴露于E12.5皮层后的分化命运 （图7a）。研究人员使用GSK-3b抑制剂CHIR99021以激活AP15内的Wnt信号通路，发现抑制剂处理后，AP15内表达转录因子CTIP2的子代神经元水平升至与AP12相似的水平 （CTIP2为决定DL神经元特征的关键决定性转录因子）。随后将AP15与分离的胚胎期E12.5皮层共培养，发现同样能诱导表达CTIP2的子代神经元的产生 （注意图7b饼状图的红色部分），而这些子代神经元在正常情况下较早分化。当Wnt信号通路被抑制时，该可塑性消失。体内实验也观察到了同样的现象：体内抑制AP15→12的Wnt信号通路能抑制分化命运的重定向。这些证据都强烈证明了，皮层发育时释放的Wnt信号是决定AP15→12分化命运可塑性的关键驱动力。

图7. 胚胎期E12.5皮层通过Wnt信号通路的激活来驱动AP15?12的重定向过程。

总之，本文通过分离并等时、异时移植顶端前体细胞及中端前体细胞，并对其子代神经元的分化命运进行追踪，确定了顶端前体细胞具有分化时程的可塑性，可通过感受细胞外Wnt信号通路，因此在暴露于发育早期的细胞外环境后，顶端前体细胞能重新倒退回至更早期的分子、电生理及神经分化状态。而终端前体细胞为分化命运确定的定向前体细胞，缺乏可逆的分化命运可塑性。这些发现确定了新皮层前体细胞在分化时程可塑性上的细胞类型多样性，即某些类型的前体细胞不受限于其正常分化时程进展的影响，在一定的条件下可倒退重回至早期的发育状态。

研究背景

大脑新皮层发育时，不同类型神经元依次分化生成，这些细胞类型可根据皮层分层、环路联系及基因表达特征进一步区分。这些神经元来源自不同类型的前体细胞，包括顶端前体细胞 （apical progenitors, APs）及中端前体细胞 （intermediate progenitors, IPs）。这些前体细胞的分子特征及神经分化能力随发育时间而推进。已知的是，APs在一开始可生成皮层深层（deep-layer-type, DL） 神经元，而随后生成浅层 （superficial-layer-type, SL） 神经元，而发育早期的IPs在初始阶段便能生成DL和SL神经元，而随后只生成SL。神经细胞分化过程是否只限定于一类前体细胞的限制性分化，我们仍不清楚；同时，我们也不清楚的是，前体细胞是否能在环境线索下倒退回至之前的分化时程状态。

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